<i>Taq</i>Man荧光定量PCR检测HIV-1 DNA方法的建立及初步应用

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2017.02.006

目的

建立基于TaqMan探针的HIV DNA荧光定量PCR检测方法，并检验其可靠性和稳定性。

方法

选择HIV-1的保守区域LTR-gag设计引物和探针，构建质粒标准品，建立检测方法，对12份HIV-1阳性标本和5份HIV-1阴性标本进行检测。将检测结果与罗氏HIV DNA定性检测试剂盒作比较。

结果

荧光定量PCR体系的检测下限为50拷贝/μl，标准曲线的相关系数为0.99，斜率为-1.65，截距为39.80；12份HIV-1阳性标本，检出率为100%；5份HIV-1阴性标本，检测结果均为阴性。该方法与罗氏HIV DNA定性检测试剂盒检测结果完全一致。采用不同方法提取的DNA再行HIV DNA检测，其差异无统计学意义（t = 0.033、P = 0.974）。

结论

成功建立了一种HIV DNA的检测方法，具有快速、特异性强以及稳定性好等优点。

关键词: 实时荧光定量PCR, TaqMan探针, 人类免疫缺陷病毒

Objective

To establish a real-time PCR assay for HIV DNA quantification.

Methods

The primers were designed according to the sequence of LTR-gag gene. A recombinant plasmid containing LTR-gag gene was constructed as a standard control. HIV DNA quantification were detected by real-time PCR assay. Reproducibility and specificity of this assay were also evaluated. HIV DNA from 12 cases with HIV-1 infection was also detected. The results were compared with Roche HIV DNA qualitative detection kit.

Results

The detection limit of the fluorescent quantitative PCR was 50 copies/μl. The correlation coefficient of the standard curves was 0.99, the slope was -1.65, and the intercept was 39.80. HIV-1 DNA from 12 cases with HIV-1 infection was successfully quantified using this assay. All the results were consistent with the results of the Roche HIV DNA qualitative detection kit, with no significant differences in the results of HIV DNA by different extraction methods (t = 0.033, P = 0.974).

Conclusion

HIV DNA detection method that is rapid, specific and repeatable was established successfully.

Key words: Real-time PCR, TaqMan probe, Human immunodeficiency virus-1

表1 NCBI数据库数据分析

错配	NCBI数据库中所占比例（%）
错配	HIV-FOR引物	HIV探针	HIV-REV引物
None	4 881（90.82）	1 924（99.70）	1 810（97.52）
3G→A	249（4.63）	—	—
4A→G	245（4.55）	—	—
9A→G	—	5（0.30）	—
引物2	—	—	16（0.86）
13G→A	—	—	5 （0.28）
14C→T	—	—	25（1.34）

表1 NCBI数据库数据分析

错配	NCBI数据库中所占比例（%）
错配	HIV-FOR引物	HIV探针	HIV-REV引物
None	4 881（90.82）	1 924（99.70）	1 810（97.52）
3G→A	249（4.63）	—	—
4A→G	245（4.55）	—	—
9A→G	—	5（0.30）	—
引物2	—	—	16（0.86）
13G→A	—	—	5 （0.28）
14C→T	—	—	25（1.34）

表2 两种方法DNA定量结果

样本编号	方法1		方法2		血浆HIV-1 RNA （拷贝/ml）
样本编号	Ct值（±s）	拷贝数	Ct值（±s）	拷贝数	血浆HIV-1 RNA （拷贝/ml）
1	25.96±0.16	4 387	26.12±0.07	3 996	6 890
2	26.68±0.11	2 833	26.82±0.11	2 613	13 458
3	24.07±0.16	13 817	24.28±0.13	12 151	189 537
4	24.97±0.18	7 993	24.95±0.30	8 113	89 231
5	24.34±0.06	11 717	24.31±0.22	11 926	165 782
6	22.99±0.03	26 558	22.96±0.03	27 115	203 563
7	28.02±0.11	1 263	28.08±0.32	1 214	7 057
8	24.02±0.06	14 208	24.02±0.27	14 211	179 437
9	24.27±0.01	12 235	24.26±0.24	12 345	153 784
10	31.29±0.05	174	31.19±0.17	185	452
11	31.47±0.15	156	31.55±0.26	148	280
12	24.41±0.11	1 1260	24.40±0.08	11 317	156 783

表2 两种方法DNA定量结果

样本编号	方法1		方法2		血浆HIV-1 RNA （拷贝/ml）
样本编号	Ct值（±s）	拷贝数	Ct值（±s）	拷贝数	血浆HIV-1 RNA （拷贝/ml）
1	25.96±0.16	4 387	26.12±0.07	3 996	6 890
2	26.68±0.11	2 833	26.82±0.11	2 613	13 458
3	24.07±0.16	13 817	24.28±0.13	12 151	189 537
4	24.97±0.18	7 993	24.95±0.30	8 113	89 231
5	24.34±0.06	11 717	24.31±0.22	11 926	165 782
6	22.99±0.03	26 558	22.96±0.03	27 115	203 563
7	28.02±0.11	1 263	28.08±0.32	1 214	7 057
8	24.02±0.06	14 208	24.02±0.27	14 211	179 437
9	24.27±0.01	12 235	24.26±0.24	12 345	153 784
10	31.29±0.05	174	31.19±0.17	185	452
11	31.47±0.15	156	31.55±0.26	148	280
12	24.41±0.11	1 1260	24.40±0.08	11 317	156 783

图1 质粒标准品浓度梯度标准曲线

图2 扩增片段的凝胶电泳结果

表3 PCR稳定性分析（拷贝/ml）

指标	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10⁴	10³	10²
Ct值	9.86	12.46	17.35	20.46	24.56	27.91	32.71
	9.75	12.32	17.68	20.08	24.31	27.02	32.29
	9.63	12.23	17.34	20.73	24.87	27.23	32.12
Ct平均值	9.75	12.34	17.46	20.42	24.58	27.39	32.37
标准差	0.11	0.11	0.19	0.33	0.28	0.46	0.30
变异系数（%）	1.18	0.91	1.09	1.59	1.14	1.69	0.93

表3 PCR稳定性分析（拷贝/ml）

指标	10⁸	10⁷	10⁶	10⁵	10⁴	10³	10²
Ct值	9.86	12.46	17.35	20.46	24.56	27.91	32.71
	9.75	12.32	17.68	20.08	24.31	27.02	32.29
	9.63	12.23	17.34	20.73	24.87	27.23	32.12
Ct平均值	9.75	12.34	17.46	20.42	24.58	27.39	32.37
标准差	0.11	0.11	0.19	0.33	0.28	0.46	0.30
变异系数（%）	1.18	0.91	1.09	1.59	1.14	1.69	0.93

1	Richman DD, Margolis DM, Delaney M, et al. The challenge of finding a cure for HIV infection[J]. Science,2009,323(5919):1304-1307.
2	Siliciano JD, Kajdas J, Finzi D, et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4⁺ T cells[J]. Nat Med,2003,9(6):727-728.
3	Goujard C, Bonarek M, Meyer L, et al. CD4 Cell Count and HIV DNA Level Are Independent Predictors of Disease Progression after Primary HIV Type 1 Infection in Untreated Patients[J]. Clin Infect Dis,2006,42(5):709-715.
4	Tsiara CG, Nikolopoulos GK, Bagos PG, et al. Impact of HIV type 1 DNA levels on spontaneous disease progression: a meta-analysis[J]. AIDS Res Hum Retroviruses,2012,28(4):366-373.
5	Véronique AF, Marie-Laure C, Stéphane B, et al. LTR real-time PCR for HIV-1 DNA quantitation in blood cells for early diagnosis in infants born to seropositive mothers treated in HAART area (ANRS CO 01)[J]. J Med Virol,2009,81(2):217-223.
6	Luo W, Yang H, Rathbun K, et al. Detection of human immunodeficiency virus type 1 DNA in dried blood spots by a duplex real-time PCR assay[J]. J Clin Microbiol,2005,43(4):1851-1857.
7	Zhang Q, Wang L, Jiang Y, et al. Early infant human immunodeficiency virus type 1 detection suitable for resource-limited settings with multiple circulating subtypes by use of nested three-monoplex DNA PCR and dried blood spots[J]. J Clin Microbiol,2008,46(2):721-726.
8	石向东，赵广录，王晓辉, 等. HIV基因芯片在艾滋病母婴传播早期诊断中的应用[J]. 现代预防医学,2005,32(6):639-641.
9	Désiré N, Dehée A, Schneider V, et al. Quantification of human immunodeficiency virus type 1 proviral load by a TaqMan real-time PCR assay. [J]. J Clin Microbiol,2001,39(4):1303-1310.
10	Morsica G, Tasca S, Biswas P, et al. Natural killer-cell cytotoxicity in HIV-positive and HIV-negative patients with and without severe course of hepatitis B virus infection[J]. Scand J Immunol,2005,62(3):318-324.
11	Soulié C, Marcelin AG, Ghosn J, et al. HIV-1 X4/R5 co-receptor in viral reservoir during suppressive HAART[J]. AIDS,2007,21(21):2243-2245.
12	Chun TW, Engel D, Berrey MM, et al. Early establishment of a pool of latently infected, resting CD4 (+) T cells during primary HIV-1 infection[J]. P Natl Acad Sci USA,1998,95(15):8869-8873.
13	Hasson H, Mantelli B, Biswas P, et al. Favorable outcome of ex-vivo purging of monocytes after the reintroduction of treatment after interruption in patients infected with multi-drug resistant HIV-1[J]. J Med Virol,2007,79(11):1640-1649.
14	Gueudin M, Damond F, Braun J, et al. Differences in proviral DNA load between HIV-1 and HIV-2-infected patients[J]. AIDS,2008,22(2):211-215.
15	Goujard C, Bonarek M, Meyer L, et al. CD4 Cell Count and HIV DNA Level Are Independent Predictors of Disease Progression after Primary HIV Type 1 Infection in Untreated Patients[J]. Clin Infect Dis,2006,42(5):709-715.
16	Désiré N, Dehée A, Schneider V, et al. Quantification of human immunodeficiency virus type 1 proviral load by a TaqMan real-time PCR assay[J]. J Clin Microbiol,2001,39(4):1303-1310.
17	Pierson T, Mcarthur J, Siliciano RF. Reservoirs for HIV-1: mechanisms for viral persistence in the presence of antiviral immune responses and antiretroviral therapy[J]. Annu Rev Immunol,2000,18(1):665-708.
18	Eriksson S, Graf EH, Dahl V, et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies[J]. PLoS Pathogens,2013,9(2):767-778.
19	焦艳梅，吴昊. HIV-1病毒储存库的特征及检测方法[J]. 国际流行病学传染病学杂志,2009,36(1):68-70.

[1]	杨桂清, 孟静静. 哺乳期亚临床乳腺炎的研究进展[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2024, 18(06): 376-379.
[2]	吴茜, 邓力, 练士贤, 张华, 江颖, 张宏伟. 伴人类免疫缺陷病毒感染乳腺癌患者的临床病理特征与预后的相关性研究[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2023, 17(03): 151-156.
[3]	丁兴欢, 王小永, 李风志, 梁博, 冯恩山. 颅内外血管搭桥联合贴敷治疗慢性颈内动脉闭塞的人类免疫缺陷病毒感染者一例及文献复习[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2024, 18(05): 314-319.
[4]	熊企秋, 邢卉春, 李宝亮, 王杨, 贾哲, 张珂, 黄容海, 蒋力. 人类免疫缺陷病毒感染对肛瘘患者接受切开挂线术治疗预后的影响[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2024, 18(05): 303-308.
[5]	戚仕轩, 阮连国. 人类免疫缺陷病毒感染快速启动抗逆转录病毒治疗研究及模式探索[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2024, 18(04): 193-199.
[6]	曾雪灵, 杨思园, 常宇飞, 赵红心, 王凌航. 176例人类免疫缺陷病毒合并肺部感染者呼吸道病原体特点与免疫学特征[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2024, 18(03): 142-148.
[7]	叶俊杰, 胡波涌. 人类免疫缺陷病毒感染者限期骨折内植物手术并发症的影响因素[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(06): 423-430.
[8]	陈珂, 孙挥宇. 人类免疫缺陷病毒感染/获得性免疫缺陷综合征患者非感染性相关眼病研究进展[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(06): 395-399.
[9]	张玉, 薛文瑞, 王鑫, 李旭瑜, 王旭东, 袁鹏飞, 梁雨润, 韩志兴, 张海建, 刘庆军, 纪世琪. 人类免疫缺陷病毒感染合并膀胱癌14例临床特点[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(05): 354-358.
[10]	崔贵香, 丁晓燕, 褚盈晖, 孙代, 吴海燕, 陈京龙. 57例人类免疫缺陷病毒感染合并Burkkit淋巴瘤患者的临床分析[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(02): 102-109.
[11]	袁瑞, 胡文佳, 桂希恩, 严亚军, 冯玲, 柯亨宁, 熊勇, 杨蓉蓉. 淋巴细胞精细分型检测在人类免疫缺陷病毒感染者/获得性免疫缺陷综合征患者中的应用[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2023, 17(02): 84-91.
[12]	张燕珍, 王锡携, 文小兰. 血清巨噬细胞迁移抑制因子对活动性肺结核分诊检测的意义[J/OL]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2023, 16(02): 200-202.
[13]	王希岗, 张波, 李鸣, 高敏, 薛建新. 神经外科手术部位感染在HIV感染者与非HIV感染者中的临床差异[J/OL]. 中华神经创伤外科电子杂志, 2023, 09(04): 228-233.
[14]	刘春林, 刘畅, 赵东岩, 李端萍, 刘建梅, 罗秋林. 利用室内质控与能力验证数据评定HBV DNA和HCV RNA测量不确定度[J/OL]. 中华临床实验室管理电子杂志, 2024, 12(02): 91-96.
[15]	李佳佳, 李凌华, 吕诗韵, 冯凯, 刘琳珊, 钟海丹, 颜婵, 刘聪. 广州市病毒学抑制失败HIV/AIDS患者的耐药特征及影响因素分析[J/OL]. 中华卫生应急电子杂志, 2024, 10(04): 207-212.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

TaqMan real-time PCR assay for the quantification of HIV-1 DNA

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

TaqMan real-time PCR assay for the quantification of HIV-1 DNA