评价全血DNA二代测序共有序列在人类免疫缺陷病毒优势准种研究中的准确性

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2021.01.005

中华实验和临床感染病杂志(电子版) ›› 2021, Vol. 15 ›› Issue (01) : 22 -28. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2021.01.005

所属专题：文献；

论著

评价全血DNA二代测序共有序列在人类免疫缺陷病毒优势准种研究中的准确性

张媛媛¹, 殷倩倩², 杜鹏程³, 丁奕博², 韩俊燕³, 林倩茹², 马丽英²^,^†(

)

^1. 102206　北京，传染病预防控制国家重点实验室，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病免室；100015　北京，新发突发传染病研究北京市重点实验室，首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所
^2. 102206　北京，传染病预防控制国家重点实验室，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病免室
^3. 100015　北京，新发突发传染病研究北京市重点实验室，首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所

收稿日期:2020-02-18 出版日期:2021-02-15
通信作者: 马丽英
基金资助:
"十三五"国家科技重大专项项目(No. 2018ZX10101002); 国家自然科学基金(No. 81871694)

Evaluation on the accuracy of consensus sequence of Next-generation sequencing of blood DNA for human immunodeficiency virus dominant quasispecies

Yuanyuan Zhang¹, Qianqian Yin², Pengcheng Du³, Yibo Ding², Junyan Han³, Qianru Lin², Liying Ma²^,^†()

^1. National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Diseases Control and Prevention, Beijing 102206, China; Beijing Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015, China
^2. National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Diseases Control and Prevention, Beijing 102206, China
^3. Beijing Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015, China

Received:2020-02-18 Published:2021-02-15
Corresponding author: Liying Ma

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引用本文：

张媛媛, 殷倩倩, 杜鹏程, 丁奕博, 韩俊燕, 林倩茹, 马丽英. 评价全血DNA二代测序共有序列在人类免疫缺陷病毒优势准种研究中的准确性[J/OL]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2021, 15(01): 22-28.

Yuanyuan Zhang, Qianqian Yin, Pengcheng Du, Yibo Ding, Junyan Han, Qianru Lin, Liying Ma. Evaluation on the accuracy of consensus sequence of Next-generation sequencing of blood DNA for human immunodeficiency virus dominant quasispecies[J/OL]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2021, 15(01): 22-28.

目的

评价二代测序共有序列对人类免疫缺陷病毒（HIV）优势准种分析的代表性和准确性。

方法

共收集29个HIV感染病例的32份全血样本，其中3个病例在随访期间发生耐药，分别采集治疗前和耐药后的两份样本。提取样本DNA，分别用二代测序和一代测序方法测定HIV pol区扩增产物序列。利用软件Sequencher（4.10.1）和Bowtie 2（v2.2.5）处理一代和二代测序数据，并利用自建分析脚本确定二代测序共有序列，利用Mega软件进行聚类分析，比较二代测序共有序列与一代测序序列的差异。

结果

聚类分析结果表明，90.6%（29/32）来自于同一样本的序列被聚类在同一分支上，平均可信度为95.5%；与一代测序序列结果相比，二代测序平均每个碱基准确率为99.6%，完全不一致位点中碱基转换占81.6%（155/190），数量最多的为鸟嘌呤（G）:腺嘌呤（A），共74个（占39.0%、74/190）。

结论

二代测序共有序列与一代测序序列具有较高的一致性，二代测序共有序列可用于HIV优势准种分析，具有较好的代表性和准确性。

关键词: 一代测序, 二代测序, 人类免疫缺陷病毒, 共有序列, 优势准种

Objective

To assess the representativeness and accuracy of consensus sequence generated from Next-generation sequencing (NGS) for human immunodeficiency virus (HIV) quasispecies.

Methods

Total of 32 blood samples from 29 patients with HIV infection were collected. Among them, 3 blood samples were collected from 3 patients when virologic failure occurred. HIV DNA pol gene was amplified and sequenced by Sanger sequencing and NGS sequencing, respectively. The sequencing data of Sanger and NGS were processed by Sequencher (v4.10.1) and Bowtie2 (v2.2.5) separately. Furtherly, the consensus sequence from NGS was defined by the homemade PERL scripts. Finally, cluster analysis was processed by Mega software and the different sites between the consensus sequence of NGS and Sanger sequencing were identified and analyzed, respectively.

Results

Cluster analysis showed that 90.6% (29/32) sequences derived from the same sample were clustered in the same branch, the average credibility was 95.5%. The accuracy of each nucleotide site in consensus sequences was 99.6% compared to Sanger sequencing. Furthermore, the 81.6% (155/190) nucleotide type of inconsistent sites was transition, and the transition between Guanine (G) and Adenine (A) was the most common with the occurrence ratio of 39% (74/190).

Conclusions

The consensus sequence of NGS sequencing could be used in the study of HIV dominant quasispecies, which could present the high accurate results with Sanger sequencing.

Key words: Sanger sequencing, Next-generation sequencing, Consensus sequence, Human immunodeficiency virus, Dominant quasispecies

表1 一代测序和深度测序PCR扩增特异性引物

引物名称	序列（5′→3′）	位置^a	片段长度（bp）	退火温度（℃）
F1a	TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT	2 057～2 085	1 291	50
F1b	ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG	2 068～2 092
RT-R1	ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC	3 370～3 348
PRT-F2	CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT	2 243～2 266	1 061	55
RT-R2	CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC	3 326～3 304	1 061	55
F1	xxx^bGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAG	2 588～2 610	431	60
R1	xxx^bTGGTGATCCTTTCCATCCCTGTGG	3 020～2 997	431	60
F2	xxx^bAGTATACTGCATTTACCATACC	2 926～2 947	400	60
R2	xxx^bCTTCTGTATGTCATTGACAGTCC	3 326～3 304	400	60

表1 一代测序和深度测序PCR扩增特异性引物

引物名称	序列（5′→3′）	位置^a	片段长度（bp）	退火温度（℃）
F1a	TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT	2 057～2 085	1 291	50
F1b	ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG	2 068～2 092
RT-R1	ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC	3 370～3 348
PRT-F2	CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT	2 243～2 266	1 061	55
RT-R2	CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC	3 326～3 304	1 061	55
F1	xxx^bGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAG	2 588～2 610	431	60
R1	xxx^bTGGTGATCCTTTCCATCCCTGTGG	3 020～2 997	431	60
F2	xxx^bAGTATACTGCATTTACCATACC	2 926～2 947	400	60
R2	xxx^bCTTCTGTATGTCATTGACAGTCC	3 326～3 304	400	60

图1 样本Sanger序列与中国主要亚型参考序列聚类图

图2 Sanger测序序列和NGS共有序列进化树

表2 NGS共有序列与Sanger序列不一致碱基类型和数量

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	H	1	1
A	M	19	12
A	R	77	23
A	T	7	6
A	W	7	7
C	A	6	5
C	G	5	4
C	H	2	2
C	M	9	6
C	S	1	1
C	T	26	10
C	Y	75	22
G	A	29	10
G	C	1	1
G	K	5	5
G	R	92	23
G	S	2	2
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
T	K	10	9
T	S	1	1
T	W	6	5
T	Y	57	24

表2 NGS共有序列与Sanger序列不一致碱基类型和数量

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	H	1	1
A	M	19	12
A	R	77	23
A	T	7	6
A	W	7	7
C	A	6	5
C	G	5	4
C	H	2	2
C	M	9	6
C	S	1	1
C	T	26	10
C	Y	75	22
G	A	29	10
G	C	1	1
G	K	5	5
G	R	92	23
G	S	2	2
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
T	K	10	9
T	S	1	1
T	W	6	5
T	Y	57	24

表3 NGS共有序列与Sanger序列完全不一致碱基类型和数量

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	T	7	6
C	A	6	5
C	G	5	4
C	T	26	10
G	A	29	10
G	C	1	1
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
合计		190	88

表3 NGS共有序列与Sanger序列完全不一致碱基类型和数量

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	T	7	6
C	A	6	5
C	G	5	4
C	T	26	10
G	A	29	10
G	C	1	1
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
合计		190	88

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Evaluation on the accuracy of consensus sequence of Next-generation sequencing of blood DNA for human immunodeficiency virus dominant quasispecies

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
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A	H	1	1
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NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	H	1	1
A	M	19	12
A	R	77	23
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A	W	7	7
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C	G	5	4
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C	M	9	6
C	S	1	1
C	T	26	10
C	Y	75	22
G	A	29	10
G	C	1	1
G	K	5	5
G	R	92	23
G	S	2	2
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
T	K	10	9
T	S	1	1
T	W	6	5
T	Y	57	24

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	H	1	1
A	M	19	12
A	R	77	23
A	T	7	6
A	W	7	7
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C	G	5	4
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C	M	9	6
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C	T	26	10
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G	C	1	1
G	K	5	5
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T	S	1	1
T	W	6	5
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NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
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A	H	1	1
A	M	19	12
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G	C	1	1
G	K	5	5
G	R	92	23
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T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
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T	S	1	1
T	W	6	5
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Evaluation on the accuracy of consensus sequence of Next-generation sequencing of blood DNA for human immunodeficiency virus dominant quasispecies

NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
A	C	9	6
A	G	74	32
A	H	1	1
A	M	19	12
A	R	77	23
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NGS序列碱基类型	Sanger序列碱基类型^a	位点数量	样本数量
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A	T	7	6
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C	A	6	5
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C	H	2	2
C	M	9	6
C	S	1	1
C	T	26	10
C	Y	75	22
G	A	29	10
G	C	1	1
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G	S	2	2
T	A	4	2
T	C	26	9
T	G	3	3
T	K	10	9
T	S	1	1
T	W	6	5
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