Expert consensus on specimen collection and detection of respiratory infectious diseases

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2022.04.001

Abstract

Abstract:

The common clinical characteristics of respiratory infectious diseases are fever and/or respiratory symptoms with complicated etiological factors, which make the selection of the specimens become multifold. The key point lies in earlier identification of the potential contagious patients from those who have respiratory symptoms in terms of prevention and control of these diseases. It is crucial to improve the knowledge and practice regarding the clinical characteristics of these diseases in medical staffs. Meanwhile, standardization of the collection of clinical specimens, selection of an appropriate examination approach, and establishment of a proper report are also important. In this regard, this expert consensus was written after a deep discussion concerning the above mentioned issues. The consensus can contribute to improving the performance of early diagnosis and identification to fight against these respiratory infectious diseases at all levels of medical institutions.

Key words: Respiratory infectious diseases, Etiological testing, Results interpretation, Expert consensus

Expert Committee on Specimen Collection and Detection of Respiratory Infectious Diseases. Expert consensus on specimen collection and detection of respiratory infectious diseases[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2022, 16(04): 217-228.

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Figures/Tables 3

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染色类型	标本类型	检测时间	检测要点	检测意义	备注
革兰染色	根据感染部位，所有标本均可送检，应拒收唾液和鼻冲洗液	初染（结晶紫） 1 min，媒染（碘液）1 min，脱色（95%乙醇）10~ 30 s，复染（沙黄）30 s	①涂片应厚薄均匀，以透过涂片能看清文字为宜；②避免过度脱色；③标本可用生理盐水冲洗（在一次性痰杯中加入15~20 ml灭菌生理盐水，剧烈震荡5~10 s，重复2~ 3次）；④对于BALF等液体标本，建议进行离心富集（3 000 r/min，5 min）	①为临床快速提供初步感染诊断方向，指导抗菌药物合理应用，减少不良反应，降低治疗成本；②评估标本质量；③可判断细菌和白细胞的相关性，如吞噬；④能够检出难以培养的苛养菌和死菌；⑤提高培养的灵敏度和特异度	①白细胞和优势菌有助于预测肺部致病菌，应报告；②质量合格的标本中，涂片有正常菌群及多种细菌（通常白细胞内有空泡或液泡），提示有吸入性肺炎，应该报告；③革兰染色可查念珠菌，但不适用于丝状真菌
抗酸染色	痰液、BALF、保护毛刷标本等	初染（石碳酸复红） 5 min，脱色（盐酸酒精）1 min，复染（亚甲蓝）1 min	①标本应进行前处理，建议使用溶痰剂（次氯酸钠）消化后离心（3 500 r/min，15 min）；②建议使用热染法，降低假阴性；③判断为"阴性"时，检测视野应> 300个，镜检时间> 5 min/张；④若临床高度怀疑，可多次送检	快速提供病原学直接依据	①不可根据鳞状上皮细胞拒收痰标本，检出即有意义；②每张玻片只能制作一份涂片，染色时涂片间距应> 1 cm
弱抗酸染色	痰液、BALF	初染（石碳酸复红） 5 min，脱色（0.5%~1%稀硫酸脱色液）1 min，复染（亚甲蓝）1 min	选取较弱的脱色剂	可以区分抗酸和弱抗酸菌，特别是诺卡菌属、红球菌属等
墨汁染色	BALF、痰液	将墨汁染液滴入制备的涂片中，加盖盖玻片	①应制备薄涂片，便于观察；②使用低倍镜寻找，高倍镜确认	对怀疑肺隐球菌病患者，可以通过呼吸道标本进行墨汁染色	检出率低，建议进行隐球菌荚膜抗原检测
六胺银染色	BALF、诱导痰、痰液（应拒收上呼吸道标本）	工作液配制10 min，高碘酸氧化15 min，工作液浸泡30~60 min，硫代硫酸钠固定3 min，复染1 min。	菌体常聚集，可低倍镜寻找视野，再转油镜观察	①可区分包囊和滋养体；②肺孢子菌体外难以培养，涂片为诊断提供直接证据	①免疫障碍人群，如AIDS、移植术后患者，不明原因肺炎可选择此染色；②阳性率：BALF > 诱导痰> 痰液
真菌荧光染色	痰液、BALF等怀疑真菌感染标本	将荧光染液滴入制备的涂片中，加盖盖玻片	①推荐汞灯光源显微镜；②试剂避免真菌污染，不能冻结	对真菌检测具有较高的敏感性（97%）和特异性（87%）^[35]
异染颗粒染色法	假膜、咽喉拭子	甲苯胺蓝染色液3~ 5 min，Albert碘液1 min	避免过度脱色	结合革兰染色，若异染颗粒阳性，可做出初步报告	建议报告格式为"发现阳性棒杆菌，文字型排列，有明显异染颗粒"

染色类型	标本类型	检测时间	检测要点	检测意义	备注
革兰染色	根据感染部位，所有标本均可送检，应拒收唾液和鼻冲洗液	初染（结晶紫） 1 min，媒染（碘液）1 min，脱色（95%乙醇）10~ 30 s，复染（沙黄）30 s	①涂片应厚薄均匀，以透过涂片能看清文字为宜；②避免过度脱色；③标本可用生理盐水冲洗（在一次性痰杯中加入15~20 ml灭菌生理盐水，剧烈震荡5~10 s，重复2~ 3次）；④对于BALF等液体标本，建议进行离心富集（3 000 r/min，5 min）	①为临床快速提供初步感染诊断方向，指导抗菌药物合理应用，减少不良反应，降低治疗成本；②评估标本质量；③可判断细菌和白细胞的相关性，如吞噬；④能够检出难以培养的苛养菌和死菌；⑤提高培养的灵敏度和特异度	①白细胞和优势菌有助于预测肺部致病菌，应报告；②质量合格的标本中，涂片有正常菌群及多种细菌（通常白细胞内有空泡或液泡），提示有吸入性肺炎，应该报告；③革兰染色可查念珠菌，但不适用于丝状真菌
抗酸染色	痰液、BALF、保护毛刷标本等	初染（石碳酸复红） 5 min，脱色（盐酸酒精）1 min，复染（亚甲蓝）1 min	①标本应进行前处理，建议使用溶痰剂（次氯酸钠）消化后离心（3 500 r/min，15 min）；②建议使用热染法，降低假阴性；③判断为"阴性"时，检测视野应> 300个，镜检时间> 5 min/张；④若临床高度怀疑，可多次送检	快速提供病原学直接依据	①不可根据鳞状上皮细胞拒收痰标本，检出即有意义；②每张玻片只能制作一份涂片，染色时涂片间距应> 1 cm
弱抗酸染色	痰液、BALF	初染（石碳酸复红） 5 min，脱色（0.5%~1%稀硫酸脱色液）1 min，复染（亚甲蓝）1 min	选取较弱的脱色剂	可以区分抗酸和弱抗酸菌，特别是诺卡菌属、红球菌属等
墨汁染色	BALF、痰液	将墨汁染液滴入制备的涂片中，加盖盖玻片	①应制备薄涂片，便于观察；②使用低倍镜寻找，高倍镜确认	对怀疑肺隐球菌病患者，可以通过呼吸道标本进行墨汁染色	检出率低，建议进行隐球菌荚膜抗原检测
六胺银染色	BALF、诱导痰、痰液（应拒收上呼吸道标本）	工作液配制10 min，高碘酸氧化15 min，工作液浸泡30~60 min，硫代硫酸钠固定3 min，复染1 min。	菌体常聚集，可低倍镜寻找视野，再转油镜观察	①可区分包囊和滋养体；②肺孢子菌体外难以培养，涂片为诊断提供直接证据	①免疫障碍人群，如AIDS、移植术后患者，不明原因肺炎可选择此染色；②阳性率：BALF > 诱导痰> 痰液
真菌荧光染色	痰液、BALF等怀疑真菌感染标本	将荧光染液滴入制备的涂片中，加盖盖玻片	①推荐汞灯光源显微镜；②试剂避免真菌污染，不能冻结	对真菌检测具有较高的敏感性（97%）和特异性（87%）^[35]
异染颗粒染色法	假膜、咽喉拭子	甲苯胺蓝染色液3~ 5 min，Albert碘液1 min	避免过度脱色	结合革兰染色，若异染颗粒阳性，可做出初步报告	建议报告格式为"发现阳性棒杆菌，文字型排列，有明显异染颗粒"

目标病原体等级	操作环境	操作人员	注意事项
有一定传染性和（或）致病性的病原体	在符合要求的生物安全实验室内进行检测	具备相应专业资质，通过考核并获得授权	①对可疑烈性呼吸道传染病（SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者标本，在采集、运送或保存过程中必须注意生物安全防护。（参考WS/T 640-2018《临床微生物学检验标本的采集和转运》）^[37]； ②对分枝杆菌而言，液体培养法阳性率与传统的改良罗氏（L-J）培养法基本一致，报告时长明显缩短，为临床早诊断、早治疗提供了可靠依据，而且为后续的药敏试验提供了菌株； ③在使用血培养瓶检测分枝杆菌时，由于分枝杆菌生长缓慢，所有培养瓶应至少孵育6周
其他传染性及致病性较弱病原体	在生物安全二级实验室内进行，尤其是接种过程及易产生气溶胶的试验	具备相应专业资质，通过考核并获得授权	①标本采集后应在2 h内尽快送到实验室，不及时运送可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡； ②不能及时送达或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑为肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等苛养菌不在此列），以免杂菌生长，但不能超过24 h； ③有研究表明，检测肺炎链球菌尿抗原有助于提高肺炎链球菌的检出率； ④对于可疑诺卡菌感染的样本，可告知实验室留意涂片结果或行弱抗酸染色并延长培养时间，提高检出率； ⑤有条件的实验室可对ICU患者、透析患者、老年患者及接触耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）定植或感染者的医护人员等，在患者入院前进行鼻拭子筛查MRSA。不建议口服万古霉素用于预防MRSA感染或清除局部定植； ⑥行军团菌尿抗原检测能对军团菌感染做出早期、快速诊断，且不受治疗影响，提高检出率，但不足之处在于仅对血清型1型军团菌敏感

目标病原体等级	操作环境	操作人员	注意事项
有一定传染性和（或）致病性的病原体	在符合要求的生物安全实验室内进行检测	具备相应专业资质，通过考核并获得授权	①对可疑烈性呼吸道传染病（SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者标本，在采集、运送或保存过程中必须注意生物安全防护。（参考WS/T 640-2018《临床微生物学检验标本的采集和转运》）^[37]； ②对分枝杆菌而言，液体培养法阳性率与传统的改良罗氏（L-J）培养法基本一致，报告时长明显缩短，为临床早诊断、早治疗提供了可靠依据，而且为后续的药敏试验提供了菌株； ③在使用血培养瓶检测分枝杆菌时，由于分枝杆菌生长缓慢，所有培养瓶应至少孵育6周
其他传染性及致病性较弱病原体	在生物安全二级实验室内进行，尤其是接种过程及易产生气溶胶的试验	具备相应专业资质，通过考核并获得授权	①标本采集后应在2 h内尽快送到实验室，不及时运送可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡； ②不能及时送达或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑为肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等苛养菌不在此列），以免杂菌生长，但不能超过24 h； ③有研究表明，检测肺炎链球菌尿抗原有助于提高肺炎链球菌的检出率； ④对于可疑诺卡菌感染的样本，可告知实验室留意涂片结果或行弱抗酸染色并延长培养时间，提高检出率； ⑤有条件的实验室可对ICU患者、透析患者、老年患者及接触耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）定植或感染者的医护人员等，在患者入院前进行鼻拭子筛查MRSA。不建议口服万古霉素用于预防MRSA感染或清除局部定植； ⑥行军团菌尿抗原检测能对军团菌感染做出早期、快速诊断，且不受治疗影响，提高检出率，但不足之处在于仅对血清型1型军团菌敏感

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