复方肃毒星提取物抑制乙型肝炎病毒cccDNA的作用

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2020.04.001

中华实验和临床感染病杂志(电子版) ›› 2020, Vol. 14 ›› Issue (04) : 265 -271. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2020.04.001

所属专题：文献；

论著

复方肃毒星提取物抑制乙型肝炎病毒cccDNA的作用

思兰兰¹, 李晓东¹, 李乐¹, 牛明², 王伽伯², 兰金初³, 徐东平¹, 刘妍¹^,^†(

)

^1. 100039　北京，解放军总医院第五医学中心临床研究管理中心
^2. 100039　北京，解放军总医院第五医学中心中药研究所
^3. 100009　北京，北京鼓楼中医院中医科

收稿日期:2019-11-02 出版日期:2020-08-15
通信作者: 刘妍
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(No. 81573676); 国家自然科学基金重点项目(No. 81930110)

Inhibitory effect of Suduxing extracts on covalently closed circular DNA of hepatitis B virus

Lanlan Si¹, Xiaodong Li¹, Le Li¹, Ming Niu², Jiabo Wang², Jinchu Lan³, Dongping Xu¹, Yan Liu¹^,^†()

^1. Viral Hepatitis Research Laboratory, Institute of Infectious Diseases and Research Center for Clinical and Translational Medicine, the Fifth Medical Centre of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China
^2. Institute of Chinese Medicine, the Fifth Medical Centre of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China
^3. Department of Chinese Traditional Medicine, Beijing Gulou Hospital of Chinese Medicine, Beijing 100009, China

Received:2019-11-02 Published:2020-08-15
Corresponding author: Yan Liu
About author:
Corresponding author: Liu Yan, Email: liuyan5360@163.com

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引用本文：

思兰兰, 李晓东, 李乐, 牛明, 王伽伯, 兰金初, 徐东平, 刘妍. 复方肃毒星提取物抑制乙型肝炎病毒cccDNA的作用[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2020, 14(04): 265-271.

Lanlan Si, Xiaodong Li, Le Li, Ming Niu, Jiabo Wang, Jinchu Lan, Dongping Xu, Yan Liu. Inhibitory effect of Suduxing extracts on covalently closed circular DNA of hepatitis B virus[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Infectious Diseases(Electronic Edition), 2020, 14(04): 265-271.

目的

研究复方肃毒星提取物（简称肃毒星）体外对乙型肝炎病毒（HBV）复制模板共价闭合环状DNA（cccDNA）的抑制作用。

方法

通过细胞计数试剂盒CCK-8检测肃毒星在恩替卡韦耐药HBV稳定复制细胞系（HepG2.A64）、野生HBV稳定复制细胞系（HepG2.2.15和HepAD38）以及肝癌细胞系（HepG2）中的毒性作用；选择安全有效的高、中、低浓度肃毒星分别处理3个细胞系，采用实时荧光定量PCR法检测细胞内HBV cccDNA水平。以高斯荧光素酶微环cccDNA（mc-cccDNA）转染HepG2细胞，同时选择高、中、低浓度的肃毒星在不同时间点作用转染mc-cccDNA的HepG2细胞，荧光素酶检测试剂盒分析相对荧光强度，计算对cccDNA的抑制率，评价cccDNA转录活性。

结果

肃毒星在HepG2.A64、HepG2.2.15、HepAD38和HepG2细胞中的半数毒性浓度分别为27.01 μg/ml、29.36 μg/ml、31.20 μg/ml和52.80 μg/ml。肃毒星对HepG2.A64、HepG2.2.15和HepAD38细胞中HBV cccDNA有抑制作用，最佳作用时间为5 d，5 d最大抑制率分别为（84.24 ± 2.1）%、（52.02 ± 4.74）%和（47.16 ± 6.69）%，与未用药处理组差异有统计学意义（P均< 0.05）。肃毒星对转染HepG2细胞后mc-cccDNA转录活性的最佳抑制率为（48.44 ± 4.54）%，抑制作用优于干扰素对照组（P < 0.05），略弱于特异性敲低mc-cccDNA的pLV-CRISPR处理对照组（P < 0.05），差异有统计学意义。

结论

肃毒星对恩替卡韦耐药型和野生型细胞系HBV cccDNA的复制及转录均有很好的抑制作用，为慢性乙型肝炎功能学治愈新药的开发提供参考。

关键词: 肝炎病毒，乙型, 共价闭合环状DNA, 肃毒星提取物, 转录活性

Objective

To investigate the inhibition effect of compound Suduxing extracts (hereinafter referred as Suduxing) on hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA).

Methods

The toxicity of Suduxing on entecavir (ETV)-resistant HBV-stably-replication cell line (HepG2.A64), wild-type HBV-stably-replication cell lines (HepG2.2.15 and HepAD38) and hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) were assessed by cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The three HBV-stably-replication cells were treated with the high, medium and low concentrations of Suduxing at different time points, respectively, and HBV cccDNA were detected by the real-time fluorescent quantitative PCR. Gaussia luciferase microcircle cccDNA (mc-cccDNA) was transfected into HepG2 cells, and HepG2 cells were treated with high, medium and low concentrations of Suduxing at different time points. Then the relative fluorescence intensity was detected by luciferase assay kit, and the inhibition rate of the cccDNA was calculated to evaluate the transcriptional activity.

Results

The toxic concentration 50% of Suduxing in HepG2.A64, HepG2.2.15, HepAD38 and HepG2 cells were 27.01 μg/ml, 29.36 μg/ml, 31.20 μg/ml and 52.80 μg/ml, respectively. Compared with the untreated group, Suduxing had better inhibitory effect on HBV cccDNA in HepG2.A64, HepG2.2.15 and HepAD38 cells. The optimal treatment time was 5 days after-treatment, and the maximum inhibition rates were (84.24 ± 2.1)%, (52.02 ± 4.74)% and (47.16 ± 6.69)%, respectively (all P < 0.05). The optimal inhibition rate of Suduxing on the mc-cccDNA transcriptional activity in HepG2 cells was (48.44 ± 4.54)%. The inhibitory effect was better than interferon-treated group (P < 0.05), and slightly weaker than the pLV-CRISPR group with specific knockdown of mc-cccDNA (P < 0.05), with significant differences.

Conclusions

Suduxing could inhibit the replication and transcription of entecavir-resistant and wild-type HBV cccDNA. The findings provide a new reference strategy for drug development to functional cure of chronic hepatitis B.

Key words: Hepatitis B virus, Covalently closed circular DNA, Suduxing, Transcriptional activity

图1 不同浓度肃毒星对HepG2.A64、HepG2.2.15、HepAD38和HepG2细胞毒性

表1 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepG2.A64细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 10.58	0.00 ± 24.89	0.00 ± 9.69
2.5 μg/ml	6.59 ± 2.61	3.72 ± 5.01	3.77 ± 2.64
5 μg/ml	35.32 ± 3.55	24.70 ± 1.40	6.34 ± 0.65
10 μg/ml	84.24 ± 2.10	43.69 ± 11.23	6.60 ± 0.46
F_组间/P值	303.159/< 0.001
F_时间/P值	93.307/< 0.001
F_{组间×时间}/P值	40.978/< 0.001

表1 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepG2.A64细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 10.58	0.00 ± 24.89	0.00 ± 9.69
2.5 μg/ml	6.59 ± 2.61	3.72 ± 5.01	3.77 ± 2.64
5 μg/ml	35.32 ± 3.55	24.70 ± 1.40	6.34 ± 0.65
10 μg/ml	84.24 ± 2.10	43.69 ± 11.23	6.60 ± 0.46
F_组间/P值	303.159/< 0.001
F_时间/P值	93.307/< 0.001
F_{组间×时间}/P值	40.978/< 0.001

表2 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepG2.2.15细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 5.10	0.00 ± 0.81	0.00 ± 3.91
2.5 μg/ml	38.46 ± 3.58	1.93 ± 0.43	0.58 ± 0.99
5 μg/ml	47.88 ± 4.30	6.64 ± 3.86	0.95 ± 8.50
10 μg/ml	52.02 ± 4.74	25.13 ± 6.01	22.03 ± 3.71
F_组间/P值	180.282/< 0.001
F_时间/P值	332.193/< 0.001
F_{组间×时间}/P值	42.117/< 0.001

表2 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepG2.2.15细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 5.10	0.00 ± 0.81	0.00 ± 3.91
2.5 μg/ml	38.46 ± 3.58	1.93 ± 0.43	0.58 ± 0.99
5 μg/ml	47.88 ± 4.30	6.64 ± 3.86	0.95 ± 8.50
10 μg/ml	52.02 ± 4.74	25.13 ± 6.01	22.03 ± 3.71
F_组间/P值	180.282/< 0.001
F_时间/P值	332.193/< 0.001
F_{组间×时间}/P值	42.117/< 0.001

表3 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepAD38细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 1.42	0.00 ± 2.31	0.00 ± 1.57
2.5 μg/ml	6.83 ± 5.20	5.54 ± 7.42	0.83 ± 1.82
5 μg/ml	12.24 ± 4.84	9.49 ± 1.22	6.01 ± 0.69
10 μg/ml	47.16 ± 6.69	14.67 ± 6.99	6.86 ± 0.73
F_组间/P值	?	115.308/< 0.001	?
F_时间/P值	?	103.171/< 0.001	?
F_{组间×时间}/P值	?	4.762/0.003	?

表3 不同浓度肃毒星作用不同时间对HepAD38细胞内cccDNA的抑制率

肃毒星	cccDNA的抑制率（ ± s，%）
肃毒星	处理5 d	处理7 d	处理9 d
0 μg/ml	0.00 ± 1.42	0.00 ± 2.31	0.00 ± 1.57
2.5 μg/ml	6.83 ± 5.20	5.54 ± 7.42	0.83 ± 1.82
5 μg/ml	12.24 ± 4.84	9.49 ± 1.22	6.01 ± 0.69
10 μg/ml	47.16 ± 6.69	14.67 ± 6.99	6.86 ± 0.73
F_组间/P值	?	115.308/< 0.001	?
F_时间/P值	?	103.171/< 0.001	?
F_{组间×时间}/P值	?	4.762/0.003	?

表4 5 μg/ml肃毒星、pLV-CRISPR和干扰素作用不同时间抑制cccDNA转录活性

组别	cccDNA转录活性抑制率（ ± s，%）
组别	处理5 d	处理7 d	处理9 d
药物未处理组	0.00 ± 5.70	0.00 ± 4.58	0.00 ± 6.57
pLV-CRISPR处理组	49.56 ± 4.44	39.32 ± 9.16	20.70 ± 4.25
IFN处理组	16.89 ± 5.67	34.06 ± 4.26	33.33 ± 6.85
肃毒星-5 μg/ml	48.44 ± 4.54	19.81 ± 6.85	12.63 ± 5.57
F_组间/P值	132.775/< 0.001
F_时间/P值	10.114/= 0.001
F_{组间×时间}/P值	12.055/< 0.001

表4 5 μg/ml肃毒星、pLV-CRISPR和干扰素作用不同时间抑制cccDNA转录活性

组别	cccDNA转录活性抑制率（ ± s，%）
组别	处理5 d	处理7 d	处理9 d
药物未处理组	0.00 ± 5.70	0.00 ± 4.58	0.00 ± 6.57
pLV-CRISPR处理组	49.56 ± 4.44	39.32 ± 9.16	20.70 ± 4.25
IFN处理组	16.89 ± 5.67	34.06 ± 4.26	33.33 ± 6.85
肃毒星-5 μg/ml	48.44 ± 4.54	19.81 ± 6.85	12.63 ± 5.57
F_组间/P值	132.775/< 0.001
F_时间/P值	10.114/= 0.001
F_{组间×时间}/P值	12.055/< 0.001

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