新型HIV-1核酸定量内标构建及验证

doi:10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2017.01.005

中华实验和临床感染病杂志(电子版) ›› 2017, Vol. 11 ›› Issue (01) : 20 -26. doi: 10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2017.01.005

基础论著

新型HIV-1核酸定量内标构建及验证

李庆¹, 刘芳¹, 岳秀娟¹, 李冰², 陈德喜¹^,^†(

)

^1. 100069　北京，首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所
^2. 100069　北京，首都医科大学附属北京佑安医院改革与绩效办公室

收稿日期:2016-10-11 出版日期:2017-02-15
通信作者: 陈德喜
基金资助:
首都卫生发展科研专项项目(No.首发2014-1-1151); 北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划(No. 2013-3-072)

Construction and verification of a novel HIV-1 nucleic acid quantitative internal standard

Qing Li¹, Fang Liu¹, Xiujuan Yue¹, Bing Li², Dexi Chen¹^,^†()

^1. Beijing Institute of HepatologyBeijing You’an Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China
^2. Office of Reform and Performance, Beijing You’an Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Received:2016-10-11 Published:2017-02-15
Corresponding author: Dexi Chen

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目的

构建一种稳定的以病毒颗粒为基础的HIV核酸定量检测内标。

方法

在实验室原有新型表型耐药载体pcDNA6.2-LTR gagpol的基础上，利用PCR扩增法在不改变p24保守区基础上突变核苷酸，经Gateway重组得到含突变碱基的pNL43-?ENV-LUC-ATTR表达载体，该载体与水泡性口膜炎病毒（VSV）质粒共转染293细胞48 h后收集上清中HIV-1内标假病毒颗粒，检测p24抗原含量，定量假病毒滴度，以倍比稀释内标质粒、内标质粒与阳性标本混合品、内标假病毒颗粒与阳性标本混合品为模板进行实时定量PCR法，观察内标质粒、内标假病毒颗粒内的核酸与内标引物探针的匹配情况，以及是否受样本探针引物的干扰。

结果

定点突变表型耐药载体pcDNA6.2-LTR gagpol内的p24保守区片段；获得仅具有1次感染性的HIV-1假病毒颗粒（3.61 × 10⁹ IU/ml）；p24抗原检测含量为283.2 pg/ml；实时定量PCR法确定内标质粒、内标假病毒颗粒内的核酸与内标引物探针匹配良好，内标引物探针对阳性标本探针无干扰。

结论

成功建立了一种以假病毒颗粒为基础的HIV-1核酸定量检测内标。

关键词: 获得性人类免疫缺陷病毒1型, 核酸定量, 病毒颗粒, 内标

Objective

To construct a stable HIV-1 nucleic acid quantitative detection of internal standard based on virus particles.

Methods

p24 region was mutated without changing p24 conservative district and inserted into phenotype resistant vector pcDNA6.2-LTR gagpol by PCR amplification method, following by the construction of pNL43-?ENV-LUC expression vector containing the specific mutation base by Gateway recombinant technology. This vector and VSV plasmid were cotransfected into 293T cell lines and HIV-1 pseudotyped virus was collected from the supernatant 48 hours later. The loads of HIV-1 were quantified by detection of p24 antigen titers. The multiproportion diluted liquids of the internal standard plasmid, the mixture of the internal standard plasmid and positive samples and the mixture of the internal standard pseudotyped viral particles and positive samples were used as the template for the real-time quantitative PCR to verify whether the nucleic acids levels matched the probes of internal standard plasmid, and whether they could be interfered by the sample probe and primers.

Results

The fragment of specific site mutation in p24 conservative region was inserted into the phenotype resistant vector pcDNA6.2-LTR gagpol. The detective p24 antigen was 283.2 pg/ml, while HIV-1 pseudotyped virus was 3.61 × 10⁹IU/ml. Internal standard plasmid and internal standard pseudotyped viral particles matched the probes of internal standard plasmid, which were confirmed using real-time quantitative PCR and not interfered by the sample probe and primers.

Conclusion

The novel internal standard construced with pseudotyped virus could be used to detect plasma HIV-1 level.

Key words: Human immunodeficiency virus type 1, Nucleic acid quantitative, Pseudotyped virus, Internal standard

图1 HIVc2和HIVc3片段PCR扩增结果

图2 HIVc4克隆后酶切结果

图3 HIVc4克隆后酶切测序验证结果

图4 p24保守区突变测序比对结果

图5 pcDNA6.2-LTR gagpol-p24t载体结构图

表1 内标扩增引物序列

名称	序列（5′→3′）
S1	AGTGGATCCA TGGGTGCGAG AG
AS1	AGCATGGTAT TTAAATCTTG TGGG
S2	CAGGAACAAATAGGATGGATGACA
AS2	TCTGAGGGAA GCTAGCGGAT ACA
检测引物上游	AATACCCATGTTTTCAGCATTATC
检测引物下游	AGATTTCTCC TACTGGGATA GG
内标引物上游	CGGCGGTCACCAGGCTGCGATGCAGAT
内标引物下游	GCTTGTTGTA CCAGCAATAT CGCTAC
内标序列	CCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACTATTAACGAAGAGGCCGCGGAGTGGACAGATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCAGTTGCACCAGGCCAGATGAAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAATACTAGTACTCTTCAGGAGCAAATAGGAT GGATGACAAA TAATCCACCTATCCCAGTAG GAGAAATCTA

表1 内标扩增引物序列

名称	序列（5′→3′）
S1	AGTGGATCCA TGGGTGCGAG AG
AS1	AGCATGGTAT TTAAATCTTG TGGG
S2	CAGGAACAAATAGGATGGATGACA
AS2	TCTGAGGGAA GCTAGCGGAT ACA
检测引物上游	AATACCCATGTTTTCAGCATTATC
检测引物下游	AGATTTCTCC TACTGGGATA GG
内标引物上游	CGGCGGTCACCAGGCTGCGATGCAGAT
内标引物下游	GCTTGTTGTA CCAGCAATAT CGCTAC
内标序列	CCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACTATTAACGAAGAGGCCGCGGAGTGGACAGATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCAGTTGCACCAGGCCAGATGAAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAATACTAGTACTCTTCAGGAGCAAATAGGAT GGATGACAAA TAATCCACCTATCCCAGTAG GAGAAATCTA

表2 PCR扩增程序（分步拼接和扩增内标序列）

扩增程序名称	步骤	片段大小（bp）
HIVc2 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	530
HIVc3 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	741
HIVc4 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	1 480

表2 PCR扩增程序（分步拼接和扩增内标序列）

扩增程序名称	步骤	片段大小（bp）
HIVc2 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	530
HIVc3 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	741
HIVc4 PCR	95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，33个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、10 min	1 480

图6 内标质粒倍比稀释后定量PCR结果

图7 内标质粒与HIV阳性血清混合后定量PCR结果

图8 p24抗原检测标准曲线

表3 p24抗原和病毒含量检测结果

样本	p24平均吸光度值	p24浓度（pg/ml）	病毒载量（IU/ml）
pNL43-LTR gagpol-p24t	1.4715	283.2	3.61 × 10⁹
VSV-G	0.122	-	-
培养基	0.104	-	-

表3 p24抗原和病毒含量检测结果

样本	p24平均吸光度值	p24浓度（pg/ml）	病毒载量（IU/ml）
pNL43-LTR gagpol-p24t	1.4715	283.2	3.61 × 10⁹
VSV-G	0.122	-	-
培养基	0.104	-	-

图9 内标质粒包装的假病毒掺入HIV病毒血清内定量PCR结果

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